Ciri istimewa dari plasmid pBR322 dan puC8 yang digunakan sebagai vektor kloning serta cara penggunaan dalam percobaan kloning

Nurul Indah : B1J006031

Irfan Rahmat Nugraha : B1J006033

Nurul Azizah Eldirani : B1J006035

K06-TD-06

Ringkasan

Vektor kloning adalah molekul DNA yang berfungsi sebagai wahana atau kendaraan yang akan membawa suatu fragmen DNA masuk ke dalam sel inang dan memungkinkan terjadinya replikasi dan ekspresi fragmen DNA asing tersebut. Vektor yang dapat digunakan pada sel inang prokariot, khususnya E. coli, adalah plasmid, bakteriofag, kosmid, dan fasmid.

Plasmid merupakan molekul DNA yang berantai ganda, berbentuk lingkaran yang tertutup, dapat bereplikasi sendiri diluar kromosom dan tidak mengandung gen-gen esensial. Jumlah plasmid di dalam sel berbeda-beda, tergantung spesies organismenya. Ukuran plasmid berkisar antara 1kb hingga lebih dari 250 kb. Plasmid pBR322 dan pUC8 merupakan contoh plasmid yang digunakan sebagai vektor kloning. Agar dapat digunakan sebagai vektor kloning, plasmid harus memenuhi syarat-syarat berikut ini:

  1. mempunyai ukuran relatif kecil bila dibandingkan dengan pori dinding sel inang sehingga dapat dengan mudah melintasinya,

  2. mempunyai sekurang-kurangnya dua gen marker yang dapat menandai masuk tidaknya plasmid ke dalam sel inang,

  3. mempunyai tempat pengenalan restriksi sekurang-kurangnya di dalam salah satu marker yang dapat digunakan sebagai tempat penyisipan fragmen DNA, dan

  4. mempunyai titik awal replikasi (ori) sehingga dapat melakukan replikasi di dalam sel inang.

Plasmid pBR322 mengandung gen penyandi resistensi terhadap ampisilin dan tetrasiklin. Adanya gen resistensi terhadap antibiotik yang di dalamnya mengandung situs enzim restriksi yang akan memudahan dalam menyeleksi plasmid rekombinan, dengan adanya enzim yang hanya memotong bagian gen yang resistens terhadap antibiotik. Misalnya, enzim BamHI yang akan memotong plasmid pBR322 pada bagian gen yang resistensi terhadap tetrasiklin (gen TetR). Proses pemotongan plasmid bukanlah sesuatu yang mudah. Ada dua kemungkinan setelah pemotongan, yaitu:

1). Plasmid pBR322 yang tersambung kembali membentuk lingkaran seperti semula, dan

2). Plasmid rekombinan yaitu plasmid pBR322 yang telah disisipi dengan DNA asing.

Plasmid pBR322 yang telah kehilangan bagian yang resistensi terhadap tetrasiklin kemudian disisipi dengan fragmen dari DNA asing. Plasmid pBR322 ini kemudian dimasukkan ke dalam sel inangnya yaitu E. coli. Pengujian lebih lanjut apakah plasmid ini telah tersisipi oleh fragmen DNA asing atau tidak adalah dengan mendedahkannya pada medium ampisilin, untuk kemudian memplatingnya ke dalam medium tetrasiklin dan ampisilin. Koloni E. coli yang telah kehilangan marker tetrasiklin akan sensitif tetrasiklin, sedangkan pada medium ampisilin, koloni ini tetap tumbuh karena masih resistensi ampisilin.

Gambar 1. Plasmid pBR322 sebagai vector cloning

Faktor plasmid puC8 mengandung gen LacZ yang menyandikan enzim β-galaktosidase yang akan memecah X-gal menjadi galaktoda dan 5-bromo-4-chloroindigo (biru). Oleh karena itu, koloni E. coli akan berwarna biru bila ditumbuhkan pada media yang mengandung X-gal. lacZ memiliki daerah polikloning yang memiliki banyak situs restriksi dari berbagai enzim restriksi. puC8 dapat dipotong oleh beberapa jenis enzim restriksi. puC8 yang telah dipotong daerah LacZnya kemudian disisipi dengan DNA asing. Percobaan selanjutnya adalah dengan menumbuhkannya pada medium tumbuh yang mengandung X-gal (5-bromo-4-chloro-indolyl-b-D-galactoside), koloni yang telah mengalami DNA rekombinan atau kehilangan LacZnya tidak akan mampu memecah X-gal menjadi 5-bromo-4-chloroindigo yang berwarna biru, dan akan tumbuh menjadi koloni warna putih.

Gambar 2. Seleksi rekombinan dengan vektor pUC8

Daftar Pustaka

Brown, T.A (2002) DNA in Genomes, 2nd ed., http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?highlight=way,Cloning%20vectors,4.2.1.&rid=genomes.section.6035#6037 diakses tanggal 24 oktober 2008

Situs Terkait

http://bima.ipb.ac.id/~tpb-ipb/materi/genetika/dnarekombinan/plasmidpdf.pdf

http://bima.ipb.ac.id/~tpb-ipb/materi/genetika/dnarekombinan/textdnarekombinanpdf.pdf

http://biomol.wordpress.com/bahan-ajar/vektor-kloning/

http://23bios1unsoed.wordpress.com/dosen/catatan-kuliah/teknik-untuk-mempelajari-dna/42-kloning-dna/

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?rid=genomes.figgrp.6042

http://www.fermentas.com/techinfo/nucleicacids/img/mappbr322.gif

Tinggalkan Balasan

Isikan data di bawah atau klik salah satu ikon untuk log in:

Logo WordPress.com

You are commenting using your WordPress.com account. Logout / Ubah )

Gambar Twitter

You are commenting using your Twitter account. Logout / Ubah )

Foto Facebook

You are commenting using your Facebook account. Logout / Ubah )

Foto Google+

You are commenting using your Google+ account. Logout / Ubah )

Connecting to %s

%d blogger menyukai ini: